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Introduzione al ciclo di Krebs

Il ciclo di Krebs, detto anche ciclo dell'acido citrico o ciclo dell'acido tricarbossilico, consiste in una serie di reazioni biochimiche di fondamentale importanza per il fabbisogno energetico delle cellule.

krebs

Molecole organiche dotate di energia (carboidrati, lipidi, ma anche proteine), vengono scisse in precedenti reazioni e, prima di entrare nel ciclo di Krebs, vengono trasformate in acetilCoA, una molecola formata da un gruppo acetile (CH3CO-) e da un trasportatore di acili, detto coenzima A.

La molecola del coenzima A

La molecola del coenzima A

La fonte privilegiata di acetil-CoA rimane comunque la glicolisi. Il gruppo acetile viene poi ossidato e l'energia ricavata viene utilizzata per la sintesi di ATP, in cooperazione con la fosforilazione ossidativa. Negli eucarioti le reazioni del ciclo di Krebs hanno luogo nella matrice mitocondriale, una soluzione densa che circonda le creste dei mitocondri: la matrice contiene, oltre all'acqua, tutti gli enzimi necessari alle reazioni biochimiche del ciclo, coenzimi e fosfati.
Il ciclo di Krebs viene controllato e regolato dalla disponibilità dei substrati NAD+ e FAD, mentre viene inibito da alte concentrazioni di NADH.

condensazione tra ossalacetato e acetile

Prima reazione: condensazione tra gruppo acetile e ossalacetato.

Il piruvato, prima di entrare nel ciclo di Krebs, viene decarbossilato. Il gruppo acetile viene ceduto al coenzima A. L'energia liberata viene sfruttata dal NAD+, che si riduce a NADH. Nella prima fase del ciclo di Krebs, l'acetil-CoA viene legato ad un composto a 4 atomi di carbonio, l'ossalacetato, che quindi forma un composto a 6 atomi di carbonio, il citrato (da cui il nome alternativo del ciclo). Quest'ultimo viene avviato poi in una serie di reazioni che consentono la sintesi di 3 molecole di NADH, 2 molecole di FADH2 ed una molecola di ATP, derivante dalla defosforilazione del GTP. Per ossidare una molecola di glucosio sono necessari quindi 2 giri del ciclo di Krebs. Infatti il glucosio, nella glicolisi viene scisso in due molecole di piruvato (molecola a 3 atomi di carbonio); un atomo di carbonio viene perso nella sintesi dell'acetilCoA da parte di ciascuna molecola di piruvato.

Si ritiene importante ricordare che:

  • il ciclo di Krebs, di per sé, non necessita della presenza di ossigeno; questo elemento è necessario nell'ultima tappa della respirazione cellulare aerobica, cioè la fosforilazione ossidativa;
  • è proprio nella fosforilazione ossidativa che l'energia liberata nelle varie tappe del ciclo di Krebs viene sfruttata per sintetizzare l'ATP in grande quantità. Infatti bisogna notare che nella fosforilazione ossidativa ogni molecola di NADH fornisce 3 molecole di ATP, ogni molecola di FADH2 fornisce 2 molecole di ATP, il GTP, come già ricordato, fornisce 1 molecola di ATP. Il bilancio totale è quindi di 12 molecole di ATP ogni giro, quindi 24 molecole di ATP per ogni molecola di glucosio "respirato".

Il ciclo di Krebs nel dettaglio

Facciamo l'ipotesi classica del piruvato proveniente dalla glicolisi. Questa molecola, prima di entrare nel ciclo di Krebs, viene sottoposta a decarbossilazione ossidativa (significa che la molecola si ossida e si libera un atomo di carbonio, sotto forma di anidride carbonica) per mezzo del complesso enzimatico piruvato deidrogenasi, per formare l'acetilCoA.

Piruvato + CoASH + NAD+ ? AcetilCoA + CO2 + NADH

Il ciclo di Krebs è costituito da otto tappe.

1a tappa

La prima è una reazione di condensazione tra ossalacetato (molecola a 4 atomi di carbonio) e acetilCoA (il gruppo acetile possiede 2 atomi di carbonio), mediata dalla citrato sintasi; si forma il citrato (composto a 6 atomi di carbonio):

formazione del nucleofilo
L'enzima strappa un protone al carbonio metilico



Meccanismo: si verifica un attacco nucleofilo da parte del carbanione metilico dell'acetilCoA al carbonio carbonilico dell'ossalacetato. Il protone viene perduto grazie all'azione dell'enzima, che funge da base forte.

formazione dell'intermedio citrilCoA
La formazione dell'intermedio citrilCoA


L'intermedio citrilCoA ha un legame tiestereo molto energetico: esso viene idrolizzato formando citrato e l'energia liberata spinge la reazione nella direzione della sintesi del citrato (?Go' = -31,4 kJ/mol)

2a tappa

Il citrato viene isomerizzato ad isocitrato per poi essere decarbossilato ad a-chetoglutarato (a-KTG). Avviene prima una deidratazione seguita da una idratazione. La reazione viene catalizzata dall'enzima aconitasi, enzima complesso contenente ferro e zolfo nel centro attivo.

 

la formazione dell'iisocitrato

Il citrato viene convertito in isocitrato attraverso la formazione dell'intermedio cis-aconitato.

L'enzima citrato sintasi viene inibito allostericamente dall'ATP.

3a tappa

Consiste in una decarbossilazione ossidativa dell'isocitrato ad a-chetoglutarato. La reazione, catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi, avviene in due tempi:

formazione dell'alfa-chetoglutarato

L'isocitrato viene deidrogenato ad alfa-chetoglutarato e biossido di carbonio

 
la formazione del succinilCoA

La sintesi del succinilCoA per ossidazione dell'alfa-chetoglutarato

L'isocitrato deidrogenasi viene stimolato allostericamente dall'ADP e dal NAD+, mentre viene inibito da ATP e NADH; quest'ultimo si sostituisce direttamente al NAD+ sull'enzima.

4a tappa

Segue una seconda decarbossilazione ossidativa con formazione di succinilCoA ad opera dell'enzima a-chetoglutarato deidrogenasi che è un complesso enzimatico con funzione e meccanismo simili a quelli della piruvato deidrogenasi: TPP (tiamina pirofosfato), FAD ed acido lipoico come gruppi prostetici. Questo enzima viene inibito dal succinilCoA e dal NADH (cioè i prodotti di reazione).

sintesi del succinato

Conversione del succinilCoA in succinato con conseguente formazione di GTP

5a tappa

Il legame tioestere tra il succinato ed il coenzima A è un legame ad alta energia (?Go' = -2,9 kJ/mol): la scissione di questo legame è quindi accoppiata alla fosforilazione della guanosina difosfato (GDP). La reazione è reversibile ed è catalizzata dalla succinilCoA sintetasi:
Image

Il gruppo ? (gamma) della GTP può essere donato all'ADP per formare ATP: la reazione è catalizzata dalla nucleoside difosfochinasi:

Vediamo qual è il bilancio:


Image

Qui di seguito viene mostrato il meccanismo d'azione della succinilCoA sintetasi (SCS):

 

meccanismo d'azione della succinilCoA sintetasi

Il meccanismo d'azione della succinil-CoA sintetasi.

a) l'energia contenuta nel legame tioestereo viene riutilizzata per inserire un gruppo ortofosfato al posto del coenzima A

b) un enzima si occupa del trasferimento intramolecolare dell'ortofosfato dal succinato all'istidina.

Il succinato viene convertito in ossalacetato in tre tappe.

6a tappa

Ossidazione del succinato a fumarato. L'enzima si chiama succinato deidrogenasi ed è una flavoproteina; contiene cioè il FAD come gruppo prostetico. Questa reazione sfrutta il FAD poiché il salto energetico è troppo piccolo per la sintesi del NADH.

sintesi del fumarato

Deidrogenazione del succinato a fumarato

7a tappa

Idratazione reversibile del fumarato ad L-malato. L'enzima è la fumarasi (detta anche fumarato idratasi). La fumarasi è ad azione stereospecifica sul doppio legame trans del fumarato: non agisce quindi sull'isomero cis del fumarato, detto maleato.

da fumarato a malato

L'idratazione reversibile del fumarato ad L-malato

8a tappa

Ossidazione del malato ad ossalacetato; la reazione è catalizzata dall'enzima L-malato deidroogenasi, NAD-dipendente. Questo enzima è presente nella matrice mitocondriale.

la rigenerazione dell'ossalacetato

Deidrogenazione del malato ad ossalacetato; quest'ultimo permette al ciclo di ripetersi

La reazione complessiva del ciclo di Krebs è la seguente:


reazione complessiva del ciclo di KrebsLa formazione dell'acetilCoA dal piruvato è una tappa irreversibile fondamentale del metabolismo degli eucarioti. L'acetlCoA ha infatti due destini:

1) ciclo di Krebs, con formazione di molecole ad alta energia e CO2;

2) sintesi dei lipidi.

Essendo così importante, la piruvato deidrogenasi ha tre sistemi di regolazione:

1) inibizione da prodotto

L'acetilCoA inibisce il componente transacetilasi mentre il NADH inibisce il componente diidrolipoil deidrogenasi, che fanno parte del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi;

2) regolazione a feedback

L'attività viene regolata dalla carica energetica della cellula. Il GTP inibisce l'attività dell'enzima, mentre l'AMP lo attiva.

3) regolazione per fosforilazione reversibile

La fosforilazione inattiva la piruvato deidrogenasi: essa viene stimolata da elevati rapporti ATP/ADP, acetilCoA/CoA e NADH/NAD. Il donatore del gruppo fosforico è l'ATP, che catalizza una chinasi specifica. Il piruvato inibisce la fosforilazione.

La defosforilazione attiva la piruvato deidrogenasi, tramite una fosfatasi specifica: la defosforilazione viene incrementata da alte concentrazioni di Ca++ che attiva la fosfatasi. L'insulina stimola la defosforilazione ed accelera la conversione del piruvato in acetilCoA e quindi quella del glucosio in piruvato.


Bibliografia

A. L. Lehninger - Principi di biochimica - Zanichelli 1983
Helena Curtis - N. Sue Barnes - Invito alla biologia (quarta edizione italiana) - Zanichelli 1996 (ISBN 88-08-11410-4)H. F. Gilbert - Basic concepts in biochemistry - McGraw Hill 2000Enger - Ross - Concepts in biology - McGraw Hill 2002

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