La fosforilazione ossidativa

Il NADH ed il FADH₂ che si sono formati nella:

• glicolisi
• β-ossidazione (ossidazione degli acidi grassi)
• ciclo dell'acido citrico (ciclo di Krebs)

sono molecole ricche di energia in quanto contengono una coppia di elettroni con un elevato potenziale di trasferimento.

Quando questi elettroni vengono donati all'ossigeno molecolare, viene liberata una grande quantità di energia libera che può essere sfruttata per la sintesi dell'ATP.

Questo processo avviene mediante una serie di trasportatori di elettroni, cioè enzimi posti sulla membrana interna dei mitocondri (proteine intrinseche di membrana). Il trasferimento degli elettroni tramite questi trasportatori produce la contemporanea traslocazione di protoni (H⁺) al di fuori della matrice mitocondriale. Si genera così una forza motrice protonica costituita da:

• gradiente di pH
• potenziale transmembrana.

L'ATP viene sintetizzato quando i protoni ritornano nella matrice mitocondriale attraverso un complesso enzimatico detto ATP-sintetasi, costituita da due unità principali dette F_o ed F₁ (F_o = canale dei protoni - F₁ = unità catalitica).

Gli elettroni vengono trasferiti dal NADH attraverso una catena composta da tre complessi enzimatici:

• NADH-Q reduttasi
• citocromo reduttasi
• citocromo ossidasi

dette pompe protoniche. Questi complessi sono fissi.

Gli altri trasportatori di elettroni sono mobili:

• ubichinone
• citocromo c

Gli elettroni del NADH entrano nella catena a livello della NADH-Q reduttasi: due elettroni vengono trasferiti al gruppo prostetico FMN (flavin mononucleotide) producendo la forma ridotta FMNH₂

Gli elettroni vengono trasferiti successivamente dal FMNH₂ ad una serie di centri Fe-S, il secondo gruppo prostetico della NADH-Q reduttasi (che contiene i centri del tipo [2Fe-2S] e [4Fe-4S]). Gli atomi di ferro passano ciclicamente dal numero di ossidazione +2 a +3 e viceversa.
Dai centri Fe-S gli elettroni passano al coenzima Q (ubichinone) che passa dalla forma ossidata Q alla forma ridotta QH₂ (ubichinolo).

Schematizzando:

L'ubichinolo QH₂ è il punto di ingresso degli elettroni del FADH₂ nelle flavoproteine: il FADH₂ appena formato non lascia l'enzima ma trasferisce gli elettroni a:

• i centri FeS della NADH-Q reduttasi e poi al coenzima Q nel caso della succinato deidrogenasi, enzima del ciclo di Krebs che fa parte del complesso multienzimatico della succinato-Q reduttasi;
• direttamente al coenzima Q nel caso della glicerolo 3-fosfato deidrogenasi (sistema navetta per introdurre il NADH citosolico, proveniente dalla glicolisi, nei mitocondri) e dell'acilCoA deidrogenasi (enzima della β-ossidazione degli acidi grassi) che hanno entrambi come gruppo prostetico il FAD.

La seconda pompa protonica della catena respiratoria è la citocromo reduttasi. Il citocromo è una proteina contenente un gruppo prostetico eme (cioè in cui è presente un atomo di ferro) che trasporta elettroni. La citocromo reduttasi contiene due tipi di citocromi detti b e c₁ oltre ad una proteina Fe-S. Nel citocromo c₁ il gruppo eme è legato covalentemente alla proteina. Il ferro del gruppo eme passa alternativamente da Fe³⁺ (forma ossidata) a Fe²⁺ (forma ridotta) trasportando un solo elettrone alla volta.
Il percorso degli elettroni è il seguente:
l'ubichinolo (QH₂) trasferisce uno dei suoi elettroni ad alto potenziale al centro Fe-S della reduttasi; l'elettrone viene trasferito sequenzialmente al citocromo c1 ed al citocromo c che lo porta via (citocromo mobile). L'elettrone rimasto nel semichinone (QH•) viene trasferito ai due gruppi eme del citocromo b che sono b₅₆₆ e b₅₆₂ che nell'insieme costituiscono un sistema ciclico tale da consentire ad un trasportatore di due elettroni come è il QH₂ di interagire con un trasportatore di un solo elettrone per volta (centro Fe-S). In pratica il ciclo schematizzato è il seguente:

Nel complesso:

La terza pompa protonica è la citocromo ossidasi che catalizza il trasferimento di elettroni dal citocromo c all'ossigeno molecolare (O₂).

4 Cyt c (+2) + 4H⁺ + O₂ → 4 Cyt c (+3) + 2H₂O

La citocromo ossidasi contiene due gruppi emeA e due gruppi ioni rame: i due eme sono detti eme a ed eme a₃ e i due ioni rame sono detti Cu_A e Cu_B.

Il ferrocitocromo c dona il suo elettrone al gruppo eme a-Cu_A; un altro elettrone viene poi trasferito al gruppo eme a₃-Cu_B dove l'ossigeno viene ridotto in tappe successive a due molecole d'acqua.

Calcoli

La forza motrice della fosforilazione ossidativa è il potenziale di trasferimento degli elettroni dal NADH o dal FADH₂ rispetto a quello dell'ossigeno. Calcoliamo il ΔG_o' per l'ossidazione del NADH da parte dell'ossigeno.
Le due possibili semireazioni di riduzione sono:

a) ½O₂ + 2e^- + 2H⁺ → H₂O E_o' = +0,82 V

b) NAD⁺ + H⁺ + 2e^- → NADH E_o' = -0,32 V

Essendo il potenziale di riduzione della a) maggiore di quello della b), il NADH si ossida rispetto all'ossigeno, per cui la reazione complessiva sarà:

½O₂ + NADH + H⁺ → H₂O + NAD⁺ ΔE_o' = + 1,14 V

L'energia libera è data da:

ΔG_o' = -n F ΔE_o' = -2 · 9,6485·10⁴ C·mol^-1 · 1,14 V = - 220 kJ/mol

che indica quindi trattarsi di un processo esoergonico.

L'energia libera derivante dall'ossidazione del NADH viene usata per sintetizzare ATP

ADP + P_i + H⁺ → ATP + H₂O ΔG_o' = + 30,56 kJ/mol

La sintesi di ATP avviene per opera di una struttura molecolare localizzata nella membrana mitocondriale interna: questo complesso enzimatico si chiama, come ho già detto ATP-sintetasi, oppure ATPasi mitocondriale od anche H⁺-ATPasi. Il flusso protonico di ritorno attraverso l'ATPasi genera ATP (ipotesi chemiosmotica).
L'ossidazione completa di una molecola di glucosio produce 36 molecole di ATP (nel caso del sistema navetta glicerolo 3-fosfato), oppure 38 molecole di ATP (nel caso del sistema navetta malato-aspartato).
Il sistema navetta è il meccanismo mediante il quale gli elettroni del NADH fornito dal citosol (ad esempio dalla glicolisi) vengono portati all'interno dei mitocondri. Il mitocondrio è impermeabile al NADH per cui vengono trasferiti solo i suoi elettroni tramite il glicerolo 3-fosfato che attraversa facilmente la membrana mitocondriale. La reazione è catalizzata dalla glicerolo 3-fosfato deidrogenasi, che è presente sia nel citosol che nella membrana mitocondriale (dove ha il FAD come gruppo prostetico, quello che trasferisce i suoi elettroni direttamente al coenzima Q). Lo schema è il seguente:

Ricordando quindi che l'ossidazione di una molecola di NADH fornisce 3 molecole di ATP mentre quella del FADH₂ solo 2 molecole di ATP, si vede che ogni volta che viene usato il sistema navetta del glicerolo 3-fosfato, si perde una molecola di ATP dato che viene usato il FADH₂ come trasportatore di elettroni alla catena respiratoria.
Questo sistema è però efficace nei tessuti dove viene richiesta un'alta velocità della fosforilazione ossidativa (ad esempio nel muscolo scheletrico e nel cervello).
Nel cuore e nel fegato le cellule sfruttano il sistema navetta del malato-aspartato. Il NADH citosolico riduce l'ossalacetato a malato, che attraversa agevolmente la membrana mitocondriale esterna; viene qui ossidato nuovamente ad ossalacetato, formando NADH dal NAD⁺. L'ossalacetato non può attraversare la membrana e viene trasformato in aspartato con una transaminazione: l'aspartato può ora passare nel citosol.
Quindi se viene usato il sistema navetta malato-aspartato non viene consumata energia e vengono quindi sintetizzate 3 molecole di ATP per ogni coppia di elettroni (cioè per ogni NADH).
La reazione complessiva, nel caso del sistema navetta del glicerolo 3-fosfato è:

Glucosio + 36ADP + 36P_i + 36H⁺ + 6O₂ → 6CO₂ + 36ATP + 42H₂O

Il rapporto P/O (cioè molecole di ATP sintetizzate per ogni atomo di ossigeno consumato) = 3 dato che vengono sintetizzate 36 molecole di ATP e sono consumati 12 atomi di ossigeno. Nel caso del sistema navetta malato-aspartato, vengono prodotte 38 molecole di ATP.

Ultimamente (febbraio 2010) ho letto sul Journal of Chemical Education che la resa effettiva è molto più bassa: pare che ciò sia dovuto al numero di subunità c che costituisce la porzione F_o dell'ATP sintetasi. Il numero di molecole di ATP prodotte dipende sia dal numero di protoni traslocati attraverso la membrana mitocondriale che dal numero di subunità c presenti; quest'ultimo numero, a sua volta, varia a seconda dell'organismo considerato.

Bisognerebbe rivedere al ribasso la resa di ATP: una stima attendibile fa oscillare il valore tra 29 e 32 molecole. Il rapporto P/O più veritiero è approssimativamente di 2,5 ATP/NADH o di 1,5 ATP/FADH₂.

Se volete uno schema attendibile e ben fatto, vi consiglio di scaricare questo file dal sito dell'International Union of Biochemistry and Molecular Biology.

Calcolo della resa

L'ossidazione completa di una mole di glucosio (combustione) produce 2872 kJ in condizioni standard:

C₆H₁₂O₆ + 6O₂ → 6CO₂ + 6H₂O ΔG_o' = -2872,14 kJ/mol

L'energia immagazzinata in 36 molecole di ATP è:

36 · 30,56 = 1100 kJ (idrolisi dell'ATP)

Quindi la resa è:

η = 1100/2872 = 0,38 circa

In percentuale 38% (utilizzando la navetta glicerolo 3-fosfato)