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Microscopio

Tra gli strumenti più importanti nello studio delle cellule e dei microrganismi c'è sicuramente il microscopio ottico. Esso assolve due importanti funzioni:

  • ingrandisce oggetti invisibili ad occhio nudo
  • permette di vedere separati due oggetti che ad occhio nudo appaiono uniti

Un uomo dotato di vista normale, per poter leggere una scritta deve porre gli occhi ad una distanza di almeno 25 - 30 cm dal foglio. A tale distanza l'occhio è in grado di separare due punti distanti almeno 0,075 - 0,1 mm. Due punti più vicini vengono quindi visti come un unico punto. Questa distanza viene detta potere o limite risolutivo dell'occhio.

Siccome le cellule degli organismi procarioti hanno dimensioni dell'ordine di 2 milionesimi di metro (2 micrometri) e le cellule eucariote hanno un diametro medio di 10 - 30 micrometri, per studiarle è necessario uno strumento ottico che ci permetta di valutarne la morfologia: con un buon microscopio ottico che utilizzi la luce bianca siamo in grado di discernere nitidamente oggetti con un diametro superiore a 0,2 micrometri. Quindi il potere risolutivo del microscopio ottico è di 0,2 micrometri e non siamo in grado di osservare oggetti di grandezza minore. Con un adatto sistema di lenti si è in grado di ottenere ingrandimenti superiori a mille volte la dimensione reale dell'oggetto osservato.

La risoluzione del microscopio ottico

Il potere risolutivo o risolvente può essere espresso come:

Image
dove λ (lambda) è la lunghezza d'onda della luce incidente, n è l'indice di rifrazione del mezzo interposto tra obiettivo e vetrino ed α (alfa = angolo di apertura della lente) è il semiangolo del cono luminoso entrante. Il prodotto al denominatore viene detto apertura numerica, è un numero adimensionale ed è un modo per esprimere l'angolo di apertura della lente dell'obiettivo senza utilizzare il grado sessagesimale.

apertura numerica di un obiettivo

Schema raffigurante l'apertura numerica di un obiettivo


Dalla formula si può osservare che modificando la lunghezza d'onda della luce utilizzata dal microscopio ottico, si può aumentare o diminuire il limite della risoluzione; tuttavia questo sistema non è molto efficace dato che l'intervallo delle lunghezze d'onda del campo visibile è abbastanza ristretto.

Un altro modo per modificare il limite di risoluzione consiste nell'utilizzare una goccia di olio da immersione come l'olio di cedro (n=1,515) da interporre tra preparato e obiettivo. Questo fluido, infatti, ha un indice di rifrazione più elevato di quello dell'aria. In questo modo aumentiamo il valore del denominatore, così che "d" diventa più piccolo; il microscopio ora riesce a risolvere due punti più vicini e l'immagine è quindi più nitida.

obiettivo ad immersione

Schema di un obiettivo ad immersione: l'olio ed il vetro hanno indici di rifrazione comparabili

Struttura del microscopio ottico

La struttura di un microscopio ottico si può suddividere in due parti principali:

  • una parte meccanica (stativo)
  • una parte ottica

schema di un microscopio ottico

Schema di un microscopio ottico: vengono evidenziate le parti più importanti


Lo stativo a sua volta è composto da:

  • un sostegno, che di solito è molto pesante; in questo modo vengono minimizzate le vibrazioni che provengono dal piano di appoggio
  • un tavolino portaoggetti, in genere mobile (piano traslatore), sul quale vengono appoggiati i vetrini, presenta un'apertura attraverso la quale passa la luce che proviene da una sorgente luminosa. Esso è raccordato al sostegno mediante un sistema di manopole che permette sia grandi movimenti del tavolino in alto e in basso (manopola macrometrica) sia spostamenti più ridotti, sempre nelle stesse direzioni, che servono per regolare la messa a fuoco dell'oggetto osservato (manopola micrometrica);

tavolino portaoggetti

Particolare del tavolino portaoggetti con l'apposita levetta utilizzata per ancorare il vetrino

manopole per la messa a fuoco

Particolare delle manopole per la messa a fuoco: sono posizionate in posizione concentrica. La più grande (esterno) è la macrometrica e serve per gli spostamenti più grossolani; la seconda (interno) è la micrometrica e viene utilizzata per la messa a fuoco più precisa

manopole per la traslazione

Mediante queste manopole si può spostare il tavolino nelle due direzioni del piano xy (traslazione del vetrino)

scala graduata del piano traslatore

Mediante questa scala graduata l'operatore può tenere traccia degli spostamenti di traslazione del piano xy

  • un tubo portalenti, connesso allo stativo: nella sua parte superiore vengono alloggiati gli oculari, che tramite un sistema meccanico a slitta possono variare la loro distanza reciproca, adattandosi alla distanza tra le pupille, che in genere è di 65 mm. All'estremità inferiore presenta un portaobiettivi a revolver sul quale sono montati gli obiettivi.

tubo portalenti

Particolare del portalenti: in alto gli oculari, in basso gli obiettivi

 

alloggiamento portaobiettivi

Particolare del porta obiettivi: il sistema può essere regolato per adattare gli oculari alla nostra distanza oculare

portaobiettivi a revolver

Particolare del portaobiettivi: viene detto a revolver, perché permette di cambiare obiettivo senza smontare o rimontare nulla ma semplicemente ruotando il supporto.

La parte ottica è composta da:

  • un dispositivo di illuminazione, composto da una lampada ad incandescenza o alogena e un condensatore; il condensatore è un sistema ottico costituito da diverse lenti, che permette di focalizzare la luce in un unico punto. Questa capacità viene regolata tramite un diaframma ad iride e ad un sistema meccanico a cremagliera che permette di regolare la distanza del condensatore dal preparato: in questo modo è possibile modificare sia la profondità di campo sia il contrasto;

sorgente luminosa

La lampada viene posta al di sotto di una lente convergente, che permette di concentrare i raggi luminosi verso il condensatore ottico

interruttore e reostato

Particolare dell'interruttore (sinistra) e del reostato (destra): con questo dispositivo siamo in grado di regolare la luce che arriva al microscopio

condensatore ottico

Particolare del condensatore ottico: è posto sotto il tavolino portaoggetto. Sulla sinistra è visibile la manopola che consente di regolare la distanza del condensatore dal tavolino

iride condensatore aperta

Particolare del diaframma ad iride: posizione aperta

iride condensatore chiusa

L'operatore può agire sulla levetta laterale e chiudere il diaframma

  • un sistema ottico, che nei microscopi composti è costituito da oculare e obiettivo:
  • l'oculare è costituito da un insieme di 2 lenti, che consente ingrandimenti compresi tra 3x (cioè tre volte le dimensioni reali e si legge "3 per") e 20x;

oculari

Particolare della testata ottica del microscopio ottico, che monta gli oculari

oculare

Un oculare del microscopio ottico: questo illustrato permette un ingrandimento di 10 volte

 

  • l'obiettivo, anch'esso composto da 2 o più lenti, può essere a secco, se tra la lente e il vetrino con il preparato deve esserci solo aria, oppure ad immersione. Gli ingrandimenti più usati sono il 10x, il 40x, il 100x (ad immersione). Moltiplicando l'ingrandimento dell'obiettivo con quello dell'oculare (per quello del prisma della testata porta oculare, se esiste) si ottiene l'ingrandimento totale.

obiettivi

Particolare degli obiettivi

Gli obiettivi portano delle iscrizioni incise sulla loro superficie esterna. Vediamo cosa significano. Sull'obiettivo a sinistra nell'ultima foto leggiamo:

40/0.65 N.A.
160/0.17

40 è il numero di ingrandimenti permesso dall'obiettivo, cioè 40 volte;

0,65 è l'apertura numerica (N.A.) di cui abbiamo parlato prima;

160 è la distanza, espressa in millimetri, che deve intercorrere tra questo obiettivo e l'oculare;

0.17 è lo spessore massimo, espresso in millimetri, che deve avere il vetrino coprioggetto.

Alcuni suggerimenti nell'uso del microscopio ottico

Come tutti gli strumenti ottici, il microscopio deve essere conservato in un luogo asciutto, al riparo dalla polvere. Tenetelo quindi sempre coperto con l'apposito panno o la custodia morbida.

Lavorate sempre in posizione comoda, possibilmente su un tavolo ampio ed alto abbastanza da permettervi di appoggiare i gomiti stando seduti, in maniera da consentire alla schiena una postura rilassata.

Fate una breve pausa ogni venti minuti circa: i vostri occhi ve ne saranno grati!

Se utilizzate il microscopio per la prima volta, ricordate di aggiustare la distanza tra le pupille: è fondamentale utilizzare la visione binoculare. Cercate di focalizzare lo sguardo al centro del campo visivo (come se voleste storcere leggermente gli occhi); quando vi sarete abituati verrà naturale farlo.

Prima di mettere il vetrino con il preparato sul tavolino, abbassate il piano. Poi mettete a fuoco con l'obiettivo ad ingrandimento minore.

Una volta stabilita la lunghezza focale, potete ruotare il portaobiettivi a revolver senza paura: l'obiettivo non colpirà il vetrino. Poi regolate il fuoco solo con la micrometrica.

Se dovete utilizzare l'obiettivo ad immersione usate questo trucco: ruotate a metà strada il revolver, chiudete quasi completamente il diaframma del condensatore (il campo di osservazione scelto si illuminerà meglio) e fate cadere una sola goccia nella zona illuminata. Poi ruotate delicatamente il revolver nella direzione opposta, in maniera tale da far aderire bene l'olio all'obiettivo e impedire la formazione di fastidiose bolle d'aria. Se c'è aria non riuscirete mai a mettere a fuoco!

Se utilizzate l'olio per l'immersione, ricordatevi di pulire bene l'obiettivo, prima di mettere via l'apparecchio, con un panno morbido: se necessario utilizzate alcol etilico. Non vi consiglio di utilizzare solventi più aggressivi, perchè potrebbero danneggiare il collante delle lenti.

Pulite le parti ottiche con un panno morbido o con un pennello adatto e morbido: le lenti si rigano con facilità. Non smontate le lenti: questo lavoro deve essere fatto da personale esperto e in ambienti adatti.


Bibliografia

S. Campari - Guida al laboratorio di microbiologia - Zanichelli 1992 - ISBN 88-08-10810-4

M.G. Fiorin - Microbiologia Principi e tecniche - Edi Ermes Scuola Milano 1993 ISBN 88-7051-123-5

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