Si chiama così la sintesi del glucosio da precursori non saccaridici e viene sfruttata durante il digiuno o durante un intenso sforzo fisico per l'enorme richiesta di glucosio da parte del cervello.
I precursori non saccaridici sono:

glicerolo (dall'idrolisi dei trigliceridi)	da cui si ottiene	diidrossiacetone fosfato
lattato (dal muscolo sotto sforzo)	da cui si ottiene	piruvato
aminoacidi	dai quali si ottiene	piruvato, ossalacetato

La gluconeogenesi sfrutta ovviamente una via metabolica che non è l'inverso della glicolisi. Infatti le tre tappe irreversibili della glicolisi sono superate da nuove reazioni:

A
nella glicolisi il fosfoenolpiruvato cede il suo gruppo fosforico ad alta energia all'ADP per dare ATP e piruvato per mezzo della piruvato chinasi
nella gluconeogenesi si deve ottenere il fosfoenolpiruvato dal piruvato. Ciò si fa attraverso la formazione di ossalacetato, in due tappe:
1.  (nei mitocondri) il piruvato viene prima carbossilato (biotina) ad ossalacetato, consumando una molecola di ATP, dalla piruvato carbossilasi (enzima soggetto a modulazione allosterica positiva da parte dell'acetil-CoA);
piruvato + CO₂ + ATP + H₂O →  ossalacetato + ADP + P_i + 2H⁺
2.  (nel citosol) l'ossalacetato viene decarbossilato e poi fosforilato a fosfoenolpiruvato a spese di un secondo legame fosforico ad alta energia dalla fosfoenolpiruvato carbossichinasi:

ossalacetato + GTP  ↔ fosfoenolpiruvato + GDP + CO₂

La somma di queste reazioni è:
piruvato + ATP + GTP + H₂O → fosfoenolpiruvato + ADP + GDP + P_i + 2H⁺
ΔG'^o = 0,837 KJ/mol

B
nella glicolisi il fruttosio 6-fosfato è fosforilato a fruttosio 1,6-bifosfato dalla fosfofruttochinasi
nella gluconeogenesi il fruttosio 6-fosfato si forma dal fruttosio 1,6-bifosfato per idrolisi dell'estere fosforico sull'atomo di carbonio C-1. Il catalizzatore è la fruttosio 1,6-bifosfatasi (sito di controllo della gluconeogenesi)
fruttosio 1,6-bifosfato + H₂O  →   fruttosio 6-fosfato + P_i

C
nella glicolisi il glucosio è fosforilato a glucosio 6-fosfato dall'esochinasi
nella gluconeogenesi il glucosio si forma per idrolisi del glucosio 6-fosfato in una reazione catalizzata dalla glucosio 6-fosfatasi (che è presente solo nel fegato e nel rene)
glucosio 6-fosfato + H₂O  →  glucosio (ematico) + P_i
Si pone l'accento sul fatto che la glucosio 6-fosfatasi non si trova nel tessuto muscolare né nel cervello dei vertebrati, per cui questi sono incapaci di fornire glucosio al sangue.

La stechiometria della gluconeogenesi è:
2piruvato + 4ATP + 2GTP + 2NADH + 4H₂O + 2H⁺ →  glucosio + 4ADP + 2GDP + 2NAD⁺ + 6P_i

ΔG'^o = -37,66 KJ/mol