Il reperto anatomico o vegetale, prima di essere osservato al microscopio, deve essere opportunamente trattato. Il pezzo, infatti, deve subire prima la fissazione, poi deve essere indurito con la paraffina, affettato e colorato. Vediamo ora più dettagliatamente tutti i vari passaggi. Prima di continuare faccio presente che il seguente procedimento deve essere eseguito da personale esperto: il livello di questa lezione è universitario.

Immagine della retina a 10X

Fissazione

Il preparato, essendo facilmente putrescibile, deve essere fissato con mezzi fisici (congelamento) o con mezzi chimici (reagenti). Tra i reagenti più usati ci sono la formaldeide (etanale) o il liquido di Carnoy composto da una parte di acido acetico (acido etanoico) e tre parti di alcol metilico (metanolo).

Disidratazione

Ha lo scopo di rendere l'ambiente cellulare via via più apolare, in modo da preparare il tessuto all'azione della paraffina. La paraffina è una miscela di idrocarburi ad elevato numero di atomi di carbonio e sono tutte molecole apolari. Si fa quindi passare il pezzo in soluzioni di etanolo sempre più concentrate, tenendovelo per un periodo di tempo consistente. Si va dall'etanolo al 75% V/V, al 95% e poi in etanolo anidro (assoluto). Poi il pezzo si tratta con opportune sostanze organiche dette rischiaranti (come Histo-Clear® Histo-Clear II ®, meno tossici dello xilene), molto apolari.

Indurimento

Il pezzo va immerso in paraffina liquida a circa 60°C e dopo un certo periodo di tempo, che dipende dalla dimensione del reperto, viene colato in appositi stampi e lasciato raffreddare a temperatura ambiente fino a completa solidificazione.

Affettatura

Il blocchetto di paraffina solida con il reperto anatomico in esso inglobato viene ridotto con un bisturi o una lametta per evitare di ottenere fette troppo larghe. Viene quindi bloccato nell'apposito morsetto del microtomo a slitta; si regola quindi lo spessore delle fettine (ottimale a 10 micrometri), i vari registri e viene infine montata la lama. Agendo sulla manovella si ottengono delle fettine che rimangono adese alla lama. Per evitare di toccare la lama con le dita (cosa che sconsiglio vivamente!), le fettine si prelevano delicatamente con un pennellino e si pongono sul vetrino portaoggetto dove si avrà l'accortezza di annotare tutte le informazioni utili (nome dell'operatore, tipo di reperto anatomico) con la matita, sulla banda sabbiata. La fetta, che di solito ha la forma di un nastrino ondulato, si stende con l'aiuto di qualche goccia d'acqua distillata a 37°C ed il vetrino viene appoggiato, con il preparato nella parte superiore, su di una piastra termostatata a 37°C, fino a completa evaporazione dell'acqua.

Colorazione

Siccome i coloranti sono a base acquosa (almeno quelli usati di solito), i vetrini vanno messi nell'Histo-Clear® per 5 minuti e poi si reidrata gradualmente il preparato con passaggi in etanolo assoluto (5 minuti), etanolo al 95% (5 minuti), al 75% (5 minuti) e infine in acqua distillata. Si colora per 5 minuti in colorante misto costituito da ematossilina (che colora i nuclei in azzurro), eosina (che colora il citoplasma in rosso) ed emallume (che colora i tessuti connettivi in verde acquamarina). Ricordo che l'ematossilina è un colorante basico e quindi acidofilo, mentre l'eosina è un colorante acido, quindi basofilo. Si effettua il lavaggio con acqua corrente e si ripetono i passaggi sopra descritti, ma in senso inverso, in modo da operare una graduale disidratazione. Nella buona pratica di laboratorio tutti i passaggi vengono eseguiti in doppio (tranne la colorazione) per attenuare l'effetto di mescolamento dei reattivi tra un passaggio e l'altro.

Montaggio

I vetrini, dopo essere stati accuratamente e delicatamente asciugati, vanno montati. Il montaggio ha lo scopo di conservare a lungo il preparato per eventuali future osservazioni. Si mettono una o due gocce di balsamo del Canada sul preparato, si appoggia il vetrino coprioggetto prima da un lato (per evitare di inglobare aria) e poi si preme per far fuoriuscire la resina in eccesso. Il tutto va messo in stufa a circa 40°C fino a completo indurimento. Il preparato è ora pronto per l'osservazione.